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吴树坤┃山葡萄酒发酵动力学及抗氧化活性研究

  1(四川理工学院,酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川 自贡,643000) 2(四川自贡三友园林工程有限公司,四川 自贡,643000)

  摘要为了研究山葡萄酒发酵过程中发酵动力学、活性物质含量及抗氧化活性的变化规律,针对发酵过程中酵母生长、酒精生成及还原糖消耗情况,应用SGompertz模型、DoseResp模型和Boltzmanm模型对其进行非线性回归分析;并测定了其在不同发酵时间总酚和****酮的含量及抗氧化活性,了解其变化规律,并对二者进行相关性分析。结果表明:所选模型对试验数据的拟合优度均大于0.995,能较好地描述发酵中的动力学特征;总酚含量呈先增加后平稳的趋势,而****酮含量呈先增加后缓慢降低的趋势,抗氧化活性总体保持上升;山葡萄酒(发酵180 h)的Fe3+还原能力、DPPH自由基和ABTS·+自由基清除能力分别比葡萄浆(浸渍前)高出260.4%、200.0%、198.8%;总酚、****酮含量与抗氧化活性呈极显著相关(p0.01),表明总酚及****酮类物质对于抗氧化能力有重要影响。

  山葡萄又名野葡萄,属葡萄科落叶藤本植物,原产中国东北、华北及朝鲜、俄罗斯远东地区,主要分布于我国东北地区,是葡萄属中最抗寒的一种,是我国寒带地区优势种植产业,由于其易栽培管理且产量效益高,西南及西北地区都已发展种植[1]。此外,山葡萄对炭疽病、黑痘病等葡萄病害具有较好的抗病能力,是一种培育抗寒、抗病葡萄品种的宝贵资源[2-3]。山葡萄果实富含对酚类、****酮类及氨基酸等对人体有益生物活性物质,具有抗氧化、防癌、抗衰老以及预防心血管疾病等作用[4-5],高品质的果实为生产优质的山葡萄酒提供了重要保障。目前对于山葡萄酒的报道多集中在对发酵过程中生物活性物质变化及发酵工艺的研究。如钟宝[6]通过响应面法确定了北冰红山葡萄酒最优的发酵条件;杨颖琼[7]分析了酸类物质、总糖、总酚及单宁物质在山葡萄酒发酵过程中的变化趋势,但这些研究均未对山葡萄酒发酵过程进行深入说明。

  发酵动力学主要是研究各种环境因素与微生物代谢活动间的相互作用随时间的变化规律,通过数学模型定量描述发酵过程,从而对发酵指标进行较为准确的预测,对扩大发酵及工业发酵生产均具有重要的指导作用[8-10]。本试验采用经典“S”模型中的SGompertz模型、DoseResp模型、Boltzmanm模型和Logistic模型对不同发酵时间山葡萄发酵液中酵母生长期数量的变化、酒精生成情况及还原糖消耗情况进行非线性拟合,选取拟合效果较好的模型对发酵过程进行定量描述,建立发酵动力学模型,为控制管理山葡萄酒发酵提供理论依据。此外,本试验测定了不同发酵时间,山葡萄酒液中总酚和总****酮含量,并结合1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法和Fe3+还原能力测定不同发酵时间山葡萄酒的抗氧化能力,分析生物活性物质与抗氧化能力之间的关系,并了解其变化规律,以期更充分地发挥山葡萄酒的功效性。

  “紫秋”山葡萄;酿酒酵母(本实验室选育);果胶酶、调硫片(含66.7%焦亚硫酸钾,33.3%碳酸氢钾):法国LAFFORT公司;白砂糖:市售一级白砂糖;芦丁标准品、没食子酸标准品、DPPH、ABTS标准品:国药集团化学试剂有限公司。

  HWS-12恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;Lynx6000高速落地离心机,赛默飞世尔科技有限公司;SPX-250生化培养箱,常州普天仪器制造有限公司;UV-1200紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;高精度数显酒精浓度计,上海点将精密仪器有限公司。

  按m(果胶酶)∶m(葡萄)=1∶25 000的比例于葡萄浆中加入果胶酶;调硫片加入量以二氧化硫在葡萄浆的终质量浓度为50 mg/L为准;浸渍时间24 h后,加白砂糖调整糖度至20°Brix,接种酵母后,28 ℃恒温发酵7 d后,倒灌进行后发酵。

  葡萄破碎后采集葡萄浆及接入酵母发酵后每12 h采取1次,将发酵液离心,取上层清液作样液。

  酵母数量:将发酵液稀释数倍滴于血球计数板上,在光学显微镜下直接计数;还原糖含量和酒精度的测定:均采用GB/T15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法,采用斐林试剂法测定山葡萄发酵液中还原糖含量并用酒精计法测定山葡萄酒的酒精度[12]。

  采用福林-肖卡(Folin-Ciocalteau)法测定山葡萄酒液中的总酚[13],总酚含量以没食子酸质量浓度等价值表示。

  参照文献[16]中方法对Fe3+还原能力测定进行测定,并计算1 mL样品相当于VC对Fe3+还原能力的质量(mg)。

  每组试验做3次平行,试验结果均以x±sd表示,应用Origin8.0软件对浸渍前山葡萄浆和不同发酵时间的发酵液试验结果进行作图分析。

  菌体生长、还原糖消耗、酒精生成情况发酵动力学模型的建立,应用Origin8.0软件[17-18]选取合适的模型,对酵母数量、还原糖含量和酒精度数据进行非线性拟合,判定系数R2越大,拟合度越高,选取拟合度最高的模型对其进行定量描述。

  应用SPSS 20软件对样品总酚、****酮含量与其抗氧化能力进行相关性分析;并对葡萄浆(浸渍前)、浸渍后(发酵0 h)及发酵后(180 h)样品中总酚、****酮含量及其抗氧化能力进行差异显著性分析。

  2 结果与分析2.1 山葡萄酒发酵过程中酵母数量、酒精度、还原糖含量的变化趋势

  由图1所示,酵母菌在0~84 h为快速生长期,随后进入平稳期,120 h后进入衰亡期,发酵阶段较为典型,酵母数量最高达1.045×108CFU/mL。酒精在0~84 h期间快速积累,84 h后酒精积累速度较缓慢,最大酒精度达11.03%vol。发酵前108 h还原糖含量快速消耗,随后还原糖含量无明显变化。由于0~84 h酵母快速生长,利用还原糖代谢生成酒精,因而还原糖快速消耗,酒精含量以较快速度上升;随后,酵母在较高酒精浓度的胁迫下和较低还原糖浓度下进入平稳期进而衰亡,从而酒精度缓慢增长,还原糖维持在较低水平,还原糖的消耗和酒精的生成几乎是对应的。由此可判断所得结果是合理的。

  由图1可得,由于酵母菌在120 h后开始进入衰亡期,而在0~120 h时酵母处于生长期和平稳期,故本研究拟对发酵0~120 h时期酵母生长情况进行非线性回归。通过不同模型进行拟合,由表1可得,SGompertz模型对酵母生长情况拟合效果最好,拟合优度R2=0.997 07,能较好地说明酵母生长情况,故选用SGompertz模型对山葡萄酒发酵过程酵母生长情况进行定量描述。拟合曲线

  图2 SGompertz模型酵母菌生长拟合曲线 Fitting curve of yeast growth in SGompertz model

  =0.998 3。故选用DoseResp模型和Boltzmanm模型对山葡萄酒发酵过程还原糖消耗情况进行定量描述。拟合曲线

  如图6所示,山葡萄酒发酵过程中总酚含量呈先上升后平稳的趋势。发酵0~72 h期间,总酚含量不断上升,因为此阶段山葡萄酒发酵剧烈,酒精含量快速增加,促进了葡萄皮和籽中的酚类物质不断浸出,使得总酚含量迅速增加,而此后酚类物质几乎浸出完全,总酚含量大致呈现平稳的趋势。

  如图6所示,山葡萄酒发酵过程中****酮含量呈先上升后略微降低的趋势。发酵0~120 h期间,****酮含量不断上升,因为此阶段山葡萄酒发酵剧烈,酒精度增加,使葡萄皮和籽中的****酮类物质更易浸出,使得****酮含量不断增加,而此后****酮含量略微呈现下降的趋势,这可能是由于酵母生长受限,发酵罐类氧气含量增加,导致一些****酮类物质被氧化。

  通过分析山葡萄酒发酵过程中总酚与****酮含量的变化可知,葡萄酒发酵过程有利于酚类及****酮类等功能物质的浸出,从而提高酒液中功效物质的含量,故喝葡萄酒比吃葡萄更能充分地汲取葡萄的有效成分。此外,发酵后期总酚和****酮含量趋于平稳,说明发酵过程中酵母菌的生长代谢对其含量变化并无太大影响,不会出现李雪[19]等人的研究中酵母菌和原始菌群生长会分解总酚的情况和****酮类物质含量在发酵后期大量减少的情况,说明山葡萄发酵中酚类物质和****酮类物质具有一定的稳定性。本试验中山葡萄酒功能物质的含量相较于其他品种葡萄酒的含量并不突出[20-22],但葡萄酒中的组分和含量是和葡萄品种[23]、产地[24-25]、气候

  2.5.1 DPPH自由基清除率的变化由图7可得,山葡萄酒发酵过程中发酵液的DPPH自由基清除能力总体呈增加趋势,这是由于山葡萄随发酵时间的增加自身的抗氧化物质不断浸出,DPPH自由基清除能力得以加强,尤其是0~120 h增长较快,此后缓慢增加。这与总酚和****酮含量变化趋势总体保持一致。而山葡萄浆发酵后(180 h)比发酵前(0 h)的DPPH自由基清除率高出161.5%。图7 DPPH清除率的变化

  2.5.2 ABTS+·清除率的变化由图8可得,山葡萄酒发酵过程酒液的ABTS+·清除能力总体呈增加趋势,这是由于山葡萄随发酵时间的增加自身的抗氧化物质不断浸出,样品酒液ABTS+·清除能力随时间增长而加强,尤其是0~120 h增长较快,此后相对趋于平稳。这与总酚和****酮含量变化趋势总体保持一致。而山葡萄浆发酵后(180 h)比发酵前(0 h)的ABTS+·清除率高出88.9%。

  还原能力增强至较高水平,此后缓慢增强。而山葡萄浆发酵后(180 h)比发酵前(0 h)的Fe3+还原能力高出120.5%。

  ·清除能力及Fe3+还原能力较发酵前(0 h)样品分别高出161.5%、88.9%和120.5%,分别比葡萄浆(浸渍前)高出200.0%、198.8%和260.4%;并结合2.4中山葡萄酒发酵过程总酚及****酮含量的变化情况发现,发酵120 h后总酚和****酮含量均趋于稳定,但抗氧化活性还在缓慢增加,说明了山葡萄中除总酚和****酮类物质外还有一些其他的抗氧化活性物质在起作用,充分表明了山葡萄酒的功效性和保健性。对于适量葡萄酒有益于人体健康等说法提供的有力的论据。

  如图10和图11所示,浸渍前(葡萄浆)、浸渍后(发酵0 h)及发酵后(180 h)的样品液中总酚、****酮含量及抗氧化能力均具有显著性差异(p

  0.01),这说明总酚、****酮含量的增加,增强了抗氧化能力,侧面证明了总酚、****酮类物质具有的抗氧化作用,同时表明了用抗氧化能力的变化规律来表征山葡萄酒发酵过程中功能活性物质的含量变化是可行的。相关性分析结果与****琴等人关于铁皮石斛多酚和****酮含量及与抗氧化活性的相关性是一致的

  contentwithantioxidantactivity注:**表示极显著相关(p0.01)。3 小结3.1 发酵动力学模型的建立运用SGompertz模型、DoseResp模型、Boltzmanm模型对各发酵参数试验数据进行非线性拟合,判定系数R2均大于0.995以上,表明所选模型能较好地对发酵过程进行定量描述。同时,通过对试验数据进行分析表明,山葡萄酒发酵的主要时期为0~84 h。3.2 总酚、****酮含量的变化总酚、****酮含量在均在发酵前期快速增加,后期含量变化不明显,秒速时时彩计划网页说明山葡萄酒发酵过程,总酚和****酮类物质具有一定稳定性,不会因为发酵菌株的生长代谢而被大量分解。而总酚、****酮含量在浸渍前(葡萄浆)、浸渍后(发酵0 h)及发酵后(180 h)的样品液中均差异显著(p0.05),说明了山葡萄经发酵制酒可以让人体更充分汲取上葡萄中的活性物质。

  3+还原能力来表征山葡萄发酵过程抗氧化活性的变化,发现其总体呈增加趋势,甚至在发酵结束时抗氧化活性也维持在较高水平,充分表明了山葡萄酒的功效性和保健性。此外,山葡萄发酵后(180 h)的DPPH清除能力、ABTS+·清除能力及Fe3+

  4 总酚、****酮含量与抗氧化活性的相关性分析通过对样品中总酚、****酮含量与其抗氧化活性进行相关性分析,总酚、****酮含量与抗氧化活性呈极显著正相关(p

  基金项目:四川省大创项目(2);泸州老窖科研奖学金项目(15ljzk05)收稿日期:2017-11-01;改回日期:2017-12-13DOI:引用格式:

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